外泌体（exosome）是由细胞多囊泡（MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡，直径约为40~100nm。其天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。外泌体携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

一、外泌体的提取

外泌体存在于人类或动物的各种体液中，由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体，必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。

外泌体提取方法主要有:差速离心、密度梯度离心、磁珠免疫、超滤法、聚合物沉淀方法、分子排阻法。

外泌体提取的基本步骤包括细胞培养培养基更换、收集培养上清、超离心提取、洗涤。以下是具体步骤：

1、细胞培养：选择适合的细胞系，培养至对数生长期，确保细胞状态良好

2、培养基更换：在细胞培养后期，将培养基更换为无外源性血清的培养基。这有助于降低背景噪音，提高外泌体的纯度。

3、收集培养上清：收集培养液，转移到离心管中，离心去除细胞和细胞碎片（一般在300~400g，10分钟）

4、超离心提取：将上清液转移到新的离心管，进行超离心（100.000g，70分钟）

5、洗涤：重悬沉淀的外泌体，通常在PBS（磷酸盐缓冲液）中，再次超离心以去除杂质

二、外泌体的鉴定

由于分离纯化手段的限制，难以获得纯度高且单一性强的外泌体，因此后续需要通过多种实验来评估外泌体样品的纯度和完整性。

据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在2014年的提议，外泌体鉴定的3个标志：透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、粒径（Nanoparticle Tracking AnalysisNTA）、蛋白标志物（Western Blot，WB）。

1、电镜成像：透射电子显微镜观察法（TEM）是从形态和大小上对外泌体进行鉴定通过负染的方法，在高倍放大下直接观察单个外泌体的形态结构和大小。但电镜会有背景的干扰，且无法区分外泌体和与其形态相近的粒子。

2、粒径检测：通过光学原理感知粒子的存在，可以从整体上对外泌体数量和直径的群体特征进行检测，具有准确、快速、重复性好等优点，是对现有外泌体鉴定方法的良好补充。但不能确认外泌体的真实存在和外泌体的完整性，不适用于复杂样品的检测。

3、Western Blot检测：采用抗原抗体特异性相结合的原理，对外泌体标志蛋白进行检测，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定，能证实外泌体成分的存在。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。

三、外泌体的应用

1、外泌体作为药物载体：实现靶向给药。外泌体具有负载“货物“并将其传递给靶细胞的能力,可用于细胞间通讯，尤其是远距离通讯。以外泌体作为药物转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。外泌体也适合递送各种化学物质、蛋白质、核酸等。Buller B等将负载 miR-146的外泌体注射至患有角质细胞瘤小鼠的肿瘤部位，发现miR-NAS有效的抑制了肿瘤的生长。

2、疾病诊断的分子标志物：不同疾病的不同类型细胞都能分泌含有不同miRNAS和RNAS的外泌体，使得从病人的体液中分离外泌体作为疾病诊断成为可能，尤其在肿瘤诊断中。除此之外，外泌体还可以应用于非肿瘤疾病的诊断。WelkerMW等研究发现血清外泌体CD81可能是慢性丙型肝炎诊断的潜在蛋白标志物。

3、促进组织修复和再生：近年的研究发现，干细胞来源外泌体是干细胞旁分泌活动的一种重要方式，可介导其促进组织再生。Chen等发现，ADSCs-exo的联合治疗可减少大鼠急性缺血性卒中的梗死面积，促进神经功能恢复。ADSCs-ex0可以避免干细胞治疗的免疫排斥、伦理问题等缺点，且具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用等优势，与单一的细胞因子比较，具有较高的安全性和更大的组织再生潜能。

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